本文摘要:本文以氮高效转基因水稻OsNRT 2.3b的两个不同品系N-04和N-08为研究对象,以非转基因亲本Nipp为对照。

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本文以氮高效转基因水稻OsNRT 2.3b的两个不同品系N-04和N-08为研究对象,以非转基因亲本Nipp为对照。在田间小区试验条件下,采用变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术分析了氮高效转基因水稻对土壤氨解细菌群落多样性的影响。第38节=wx _ fmt=png)填料:=边宽:=发现不同生育期水稻品种间水稻土中氨解细菌的丰富度指数没有明显差异。

在两种处理条件下,土壤氨解菌N-04的shannon wiener指数仅在拔节期与Nipp有显著差异,在其他生育期无显著差异;在施氮条件下,土壤氨解菌N-08与Nipp在拔节期、抽穗开花期的shannon wiener指数无显著差异,而在不施氮条件下,仅在拔节期有显著差异。与Nipp相比,n04的土壤氨解菌均匀度指数在整个生育期无显著差异,而n08在拔节期显著高于Nipp。

测序结果表明,氮高效转基因水稻(n08和n04)在土壤中比Nipp具有更好的亚硝基索斯匹拉和亚硝基索单胞菌。指出高氮效率转基因水稻个体生育期的香农-维纳指数和均匀度指数存在明显差异,更不利于促进土壤铵态氮向硝态氮的转化。

前言从1996年到2015年,全球转基因作物的总种植面积超过了前所未有的20亿hm2,转基因作物已经成为现代农业史上发展迅速的作物。然而,在转基因作物给人们带来巨大经济效益的同时,其带来的生态安全问题也引起了公众的关注,尤其是对土壤微生物群落多样性的影响。

有研究指出,种植转基因棉花可以显著增加土壤细菌和真菌的数量,改变其群落组成。也有报道称转基因作物的种植对土壤微生物群落结构没有明显影响。然而,为了更好地理解和评价转基因植物对土壤微生物的影响,我们不应该在研究和分析整个微生物群落的过程中研究转基因植物对土壤指挥微生物的影响。

氨解细菌作为微生物生态学研究中的指挥微生物,也是继续进行硝化第一步(氨水解为亚硝酸盐,即硝化速率的限制性步骤)的关键微生物,在土壤氮素循环中占有最重要的地位,但其群落组成更容易不受气候条件、土壤使用模式和植被类型的影响,因此引起了相关领域科学家的广泛关注。高氮效率转基因水稻OsNRT 2.3b是通过转基因技术将水稻高亲和性硝酸盐转运蛋白OsNRT 2.3b基因导入受体而获得的超级传递材料。

范等人和发现,与常规水稻相比,光温敏核不育系2.3b的总累积氮、铵态氮吸收速率、氮素利用效率和单株产量分别提高了21%、12%、40%和30%。由于土壤氮素循环多年处于动态平衡状态,种植氮高效转基因水稻必然会从土壤中吸收更好的氮素,改变土壤氮素的动态特征,进而可能影响土壤氨解细菌的群落结构。本研究采用聚合酶链反应-DGGE技术,研究了氮高效转基因水稻OsNRT2.3b的两个不同菌株N-04和N-08中土壤氨解细菌16S rDNA基因的群落结构和多样性,为科学评价氮高效转基因水稻对土壤微生物的影响提供理论依据。

1材料与方法1.1实验场地调查和实验设计试验在农业部环境保护研究与监测研究所网络室进行。种植小区周围和底部为混凝土结构,内部长度、长度和高度均为1 m,小区土壤为潮土,天津市津南区未种植作物,仅磷含量为
氮源(20gm-2)为尿素[CO(NH2)2],其中50%用作基肥,50%不作追肥,追肥在水稻分蘖后期使用。磷酸二氢钾(P2O 5:15gm-2-2)和硫酸钾(K2O:18gm-2)分别用作磷肥和钾肥,均用作基肥。1.2试验所用的水稻是两个不同的氮高效转基因水稻OsNRT 2.3b及其非转基因亲本日本晴的品系N-04和N-08,均来自南京农业大学资源与环境科学学院植物营养分子生物学实验室。

2015年5月8日在栽培盘中收获水稻种子,每穴5粒,6月25日移动。选择生长相同的水稻幼苗,每块地修剪20株水稻。1.3土壤样品的采集土壤样品在分蘖期(7月27日)、拔节期(9月8日)、抽穗开花期(10月10日)和成熟期(11月12日)采集。

采集土样时,清除表面的杂草和枯枝落叶,在距水稻主茎20 cm深处采集直径3.5 cm的土样,每个样地3个采样点。将不同群落的样品混合,置于-20冰箱中进行土壤氨解细菌群落多样性分析。1.4测定方法1.4.1从土壤微生物中提取总DNA在本研究中使用了Mo Bio公司的powerlyzer powersoildna分离试剂盒(美国加利福尼亚州索拉纳海滩莫生物实验室)。

将0.5 g新鲜土壤放入玻璃珠管中,根据操作者的解释逐渐提取。从土壤中提取的脱氧核糖核酸用1.5%琼脂糖凝胶检测,并保持在-20。1.4.2PCR扩增(巢式PCR扩增氨解菌16S rDNA基因序列。引物和反应条件见表1。

第一次聚合酶链反应产物大小为465 bp,聚合酶链反应体系为50 L(每个引物0.5 L,预混物ex Taq 25 L,两次溶解的土壤DNA模板5L,用消毒水补充至50 L)。第二次聚合酶链反应产物的大小为250个碱基,聚合酶链反应体系为50 L(每个引物0.5 L,预混物ex Taq 25 L,第一次聚合酶链反应产物5L,添加消毒剂至50 L)。

1.4.3变形梯度凝胶电泳(DGGE)检测和条带重复使用聚合酶链反应产物根据操作者的解释,使用Bio-Rad公司(Bio-Rad,美国)的DcodeTM标准化变异检测系统进行检测。主要步骤如下:聚丙烯酰胺浓度为8%,变性梯度为40%~60%(100%变性剂含7molL-1尿素和40%(V/V)去离子甲酰胺),60加压,再向凝胶孔中加入30 L PCR产物(混有加载缓冲液),先在60下加入,电泳后样品用sybr green (1 10 000)染色30 min,然后用Gel Dox XR凝胶光学系统(Bio1.4.4条带的纯化、克隆和测序。

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重复使用后,用不含气相色谱片段的338f和518r引物扩增条带,用wizad r SV凝胶和聚合酶链反应清除系统试剂(Progema,美国)纯化聚合酶链反应产物。并将其与载体pGEM -T EasyVector(Progema,USA)连接,转化为(4培养8 h)。取培养的白色菌落疫苗,在LB液体培养基中37培养8 h,阳性克隆送去测序。

测序结果经NCBI Blast验证分析,获得了相似的典型菌株序列。1.5数据分析:采用SAS 9.1.3(Tukey的测试)对测试数据进行分析,采用Quantity One 4.6.2软件进行数字处理和聚类分析。利用香农维纳指数(h)、均匀度指数(en)和丰富度指数(s)评价土壤氨解细菌16S rDNA基因多样性,其计算公式如下:h=- pilnpien=h/LNS,其中h代表香农维纳指数;Pi表示ith波段与总强度的比值;En代表均匀度指数;s代表非凡的富裕指数。

2结果与分析2.1土壤氨解细菌16S rDNA基因的DGGE分析表明,n04、n08和Nipp在各生育期的DGGE指纹图谱大多为全带,只有少数属于不同的带。在氮弛豫条件下(图1),n04在拔节期只有两个不同于Nipp的条带(1B-2和1 b-4);n08和Nipp在分蘖期、抽穗开花期和成熟期有4个不同的条带(1A 3号和1A 5号;1C-4;1D-5 ).在不施氮条件下(图2),n04在分蘖期、抽穗开花期和成熟期与Nipp有一个不同的条带(2a-2;2C-5;2D-4);n08和Nipp在4个生育期(2A-5和2a-7;2B 1号;2C-3、2C-4、2C-6和2C-8;2D-6 ).2.2土壤氨解细菌16SrDNA基因多样性分析根据DGGE指纹图中各条带的灰度比值,分析了种植有N-04、N-08和Nipp的土壤氨解细菌的16S rDNA基因丰富度指数(s)、shannon wiener指数(h)和均匀度指数(en)。结果表明,n04、n08和Nipp的土壤非常丰富度指数在各生育期并不总是表现出显著差异(表2和表3)。

施氮条件下,土壤氨解细菌N-08的香农维纳指数在拔节期显著高于Nipp,但在抽穗开花期显著低于Nipp,而N-04在分蘖期、拔节期和成熟期并不总是表现出明显的差异,仅在抽穗开花期显著高于Nipp(表2)。在不施氮的条件下,n08的土壤氨解细菌香农-维纳指数在分蘖期、抽穗开花期和成熟期并不总是表现出明显的差异,但在拔节期显著低于Nipp。除了n04的抽穗开花期显著高于Nipp外,Nipp与其他时期无明显差异(表3)。在氮松弛和不施氮的条件下,N-04和Nipp在不同生长期土壤氨解菌的均匀度指数上没有显著差异(表2)。

n08仅在拔节期显著高于Nipp,其他生育期与Nipp无显著差异(表3)。2.3土壤解氨细菌16S rDNA基因测序结果及系统发育分析根据土壤解氨细菌的DGGE指纹(图1、图2)及条带灰度比值,在松弛氮条件下筛选出32条条带,在不施氮条件下筛选出29条条带,进行克隆测序,并报道NCBI序列检查分析。结果每个选择的条带和未知序列之间的相似性在96%和100%之间(表4和5)。

将测序得到的基因序列与Genbank中的其他相似序列进行比较,绘制系统发育根,进行系统发育分析(图3和图4)。根据系统发育树的根,氮处理的32个阳性克隆和未氮处理的29个阳性克隆主要属于未培养的变形菌亚硝基螺。

和亚硝基单胞菌。n08的优势家族是亚硝基松毛虫。而N-04和Nipp的优势科都无法培养-变形菌。

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根据土壤氨解细菌的DGGE指纹图谱和条带检测结果,发现n08共有6条条带属于亚硝化细菌。在-变形菌中,有3个条带属于亚硝化细菌。

在氮弛豫条件下,上述细菌在每个生长期有6条n04带。在不施氮的条件下,n08有6个条带属于亚硝化菌。和亚硝基松毛虫。

在-变形菌中,n04有5条条带,而Nipp只有一条属于亚硝基松毛虫的条带。因此,亚硝基螺属的条带数。

和亚硝基单胞菌。n08和n04显著低于Nipp。

目前,转基因水稻生态环境安全性评价的研究主要集中在基因漂移、目标和非目标生物的影响以及农业生态环境方面。近年来,转基因生物的释放是否会影响土壤微生物成为研究热点。

陈立华等研究发现,抗真菌转基因水稻秸秆的水解对土壤细菌数量没有明显影响,转基因土样与非转基因土样的土壤细菌丰富度、多样性指数和均匀度指数没有明显差异。然而,陈晓文等人发现,在全生育期,Cry1Ac基因和Cry1Ab基因水稻土壤中的细菌数量显著低于非转基因亲本,但影响持续时间较短。

陈立华等人还证实了广谱抗真菌蛋白转基因稻草的水解对土壤中可培养真菌的数量和真菌群落结构有影响,但这种影响会持续一段时间。研究发现,施氮和不施氮的拔节期,n08土壤解氨细菌香农-维纳指数在抽穗期和开花期显著低于Nipp,其他时期差异不显著。这与金等人的研究结果完全一致,他们还发现转基因大豆的土壤氨水解细菌香农-维纳指数只有在收获期间才显著增加。

本研究还发现,在施氮和不施氮条件下(抽穗开花期除外),N-04和Nipp在土壤解氨细菌香农维纳指数上没有显著差异,说明了一段时间内氮高效转基因水稻本身对土壤解氨细菌的影响,但不同播种处理和不同生育期的土壤解氨细菌香农维纳指数差异不大。这与金凌波对转基因大豆土壤微生物群落水平的研究结果相似。Heuer等人利用T4溶菌酶基因研究了马铃薯根际微生物群落结构,发现其主要与季节、种植地点和年份有关。

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本文对土壤氨解细菌均匀度指数进行了研究。发现n08和Nipp在分蘖期、抽穗开花期和成熟期差异不显著,但在拔节期显著高于Nipp。邵景鑫和徐光辉也证明了这一现象。

转基因大豆中发现的土壤氨解细菌的均匀度指数仅在生长旺盛期显著高于非转基因品种。董联华的研究还发现,转Bt CpTI基因棉花的土壤氨解菌均匀度指数在开花铃期显著高于非转基因材料,其他时期没有发现显著差异,这与本研究的结果完全一致,解释了氮高效转基因水稻在一段时间内对土壤氨解菌均匀度指数的影响。亚硝基,亚硝基单胞菌的一个家族单胞菌属。

在硝化第一阶段的亚硝化中起主导作用,可促进NH4水解为NO2-,并具有相同的耐受CO2的能力。亚硝基松毛虫。可作为硝化细菌将亚硝酸盐水解为硝酸盐。

在本研究中,施氮和不施氮的情况下,属于亚硝化反硝化细菌的氨水解细菌显著减少。和亚硝基单胞菌。

在氮高效转基因水稻(n04和n08)的土壤中。因此,种植n04和n08并不能提高土壤中铵态氮向硝态氮的水解。本研究还对各生育期土壤硝态氮和铵态氮含量进行了分析(本文未列出结果)。

结果表明,n08和n04的土壤硝态氮含量明显低于Nipp,而铵态氮含量明显高于Nipp,进一步证明种植氮高效转基因水稻不利于土壤铵态氮向硝态氮的转化。结论(1)在施氮和不施氮条件下,氮高效转基因水稻(n04和n08)和非转基因水稻(Nipp)各生育期的DGGE指纹大多为全带。

(2)n04和n08土壤氨解细菌的香农-维纳指数和均匀度指数仅在少数时期与Nipp有显著差异,说明氮高效转基因水稻本身在一段时间内对土壤氨解细菌群落的多样性有影响。(3)属于亚硝化菌属和亚硝化菌属的氨水解细菌数量。

氮-04和氮-08转基因水稻在土壤中的含量显著低于氮磷钾,说明种植氮高效转基因水稻不利于土壤铵态氮向硝态氮的转化。

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